2015年，屠呦呦获得诺贝尔生理和医学奖的消息振奋国人，也使疟疾（malaria）这种致死性疾病再次进入公众视野。疟疾是由致病性疟原虫（Plasmodium parasites），尤其是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）引起的，经蚊子叮咬传播。得益于青蒿素类药物的广泛使用，近几十年来疟疾的发病率出现实质性下降。去年，世卫组织已宣布我国为无疟疾国家[1]。但世界范围内，疟疾仍然是威胁公共健康的主要病原之一：全球半数人口面临感染风险，仅2020年就有超过2.41亿人确认感染，导致超过62.7万死亡病例且主要是儿童[2]。目前，WHO建议疟原虫中高发区域内的儿童广泛接种一款疟疾疫苗RTS,S/AS01[3]，该疫苗可显著降低儿童疟疾感染和重症死亡风险，尽管注射一年以后的保护效果降低至35%以下[4]。
Pf的生命周期包括若干阶段，每个阶段的蛋白表达谱各异。这成为高效疫苗开发的天然障碍，但也提供一种独特的防控机会，即靶向pf各生命阶段不同关键蛋白以阻断传播链。前期研究发现，靶向疟原虫有性阶段的抗原或蚊子蛋白的传播阻断疫苗（TBV）可在人体中诱导抗体阻断Pf传播至按蚊（Anopheles）类传播媒介[5]。因此，TBV可作为抗感染型疫苗的辅助，共同减少疟疾传播。
研究发现，最高效的Pf传播阻断抗体靶向Pfs48/45[6]，一种保守的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白，表达于雄性配子表面，对其生育能力至关重要[7]。但基于Pfs48/45的TBV开发却挑战重重，因为重组的Pfs48/45蛋白表达质量和产量皆不足。目前的改造策略是将Pfs48/45 6C结构域融合其N端区域的R0结构域以促进蛋白表达、折叠，提高稳定性[8]，该抗原疫苗现已进入临床I期试验（NCT04862416）。
为拓展抗原设计方法，2022年8月16日，加拿大Jean-Philippe Julien领导的研究团队在Immunity上发表了文章Vaccination with a structure-based stabilized version of malarial antigen Pfs48/45 elicits ultra-potent transmission-blocking antibody responses。研究人员探索将此前在病毒抗原设计中使用的基于结构的理性设计方法应用于TBV抗原改造，以期增强Pfs48/45 6C结构域的构象稳定性、提高应对Pf的传播减弱活性（TRA）。
来看具体研究结果。作者首先分析已发表的Pfs48/45 6C与高效传播阻断单抗TB31F的结构[9]，在TB31F表位之外找出12个潜在稳定6C折叠的候选突变位点，经重组表达检测，仅G397L突变可显著提高抗原的解链温度（Tm）近10℃。在此基础之上，使用6C G397L突变体结合Rosseta软件进一步提高热稳定性，经计算获得约4000种点突变，高得分突变集中分布于4个区域。作者由此构建7个6C-单抗原-改造（6C.sAgE）并进行重组表达，发现6C.sAgE7（G397L+H308Y）的Tm提高得最多，达到69.8℃±0.3℃；且6C.sAgE7更不容易产生聚集，在分子筛柱上主要呈现单体的洗脱峰。而且在更长的时间（4周）和更多温度（-20℃/4℃/40℃）下，6C.sAgE7未出现二级结构、未发生聚集或降解、也不结合TB31单抗，说明在长期的热胁迫下，6C.sAgE7也可维持出色的稳定性结构，表明对6C.sAgE7的改造修饰可显著提升其整体生理特性。
那么抗原改造提升后的生理特征是否有助于提升其免疫原性和Pf的TRA呢？作者使用5μg剂量的不同Pfs48/45-6C抗原（6C.WT、6C.sAgE3、6C.sAgE5、6C.sAgE7）分别免疫CD-1小鼠，以21天间隔免疫两次，在第42天评估小鼠。与此同时，作者还利用CoPoP多聚平台技术[10]，将上述Pfs48/45-6C抗原通过His标签结合于含钴元素的“CPQ”免疫原脂质体上，再免疫小鼠。至免疫终点时，通过ELISA分析各组样品，发现不同Pfs48/45-6C抗原间无显著差异，但各抗原CPQ剂型的ELISA读值明显升高（6C.sAgE3仅观察到上升趋势），说明CoPoP剂型可增强Pfs48/45-6C抗原诱导抗体的滴度。作者随后检测各抗原的TRA，发现6C.sAgE7组纯化的IgG抗体可完全阻断pf传播，说明高热稳定性的6C.sAgE7抗原可诱导产生更高水平的阻断抗体。上述结果显示，提高抗原的热稳定性并进行多聚化剂型改造促进高质量抗体反应的产生。
于是，作者在6C.sAgE7基础上继续进行改造，以进一步提高其生理特性，获得两个构建6C.mAgE1（G397L+H308Y+I402V）和6C.mAgE2（G397L+H308Y+I402V+S361R+D373S），两者的Tm分别提升至72.2℃和72.3℃，且两个构建在HEK293F细胞中正确折叠的表达产率大幅提高、并可分泌至培养基上清中。
作者随后解析出6C.mAgE1的晶体结构，通过与6C野生型结构比较，分析突变对结构稳定性提升的帮助，发现：H308Y可增强与邻近I393残基的范德华力，还额外提供一个羟基，与D382的间距在氢键范围之内，可能增强该区域的整体折叠稳定性；G397L可在疏水口袋中引入一个烃基侧链，与邻近残基形成一系列范德华力相互作用；I402V使侧链减少一个甲基，可缓解邻近残基侧链密集堆积形成的疏水口袋的空间位阻。作者还使用氢氘交换质谱（HDX-MS）检测上述突变对6C.sAgE7和6C.mAgE2之间结构动态的影响，但由于两者结构高度相似，未能发现显著差异。此外，在加速热稳定性胁迫实验中，6C.mAgE1和6C.mAgE2均未显示出聚集或降解的迹象。因此，上述结构分析为抗原生理特性和功能性的提高提供分子细节。
接下来，作者研究抗原改造特征与激发的抗体免疫间的对应关系。作者在6C.mAgE2上引入4个或6个N-糖基化修饰位点（6C.mAgE2+4Gly、6C.mAgE2+6Gly）以遮蔽抗原表面除TB31F表位之外的大部分区域，而后使用6C.mAgE2、6C.mAgE2+4Gly、或CPQ剂型的6C.mAgE2+6Gly免疫小鼠两次。结果显示，各组的ELISA读值接近，6C.mAgE2+4Gly和6C.mAgE2+6Gly组抗血清识别经典的TB31F表位及糖修饰表位，且两组纯化出的IgG抗体的TRA阻断效果分别降低至86.3%和38.3%，说明引入的糖修饰遮蔽抗原表位，导致多克隆抗体反应效力降低。由此也说明，TB31F表位本身不足以产生高效的传播阻断。
作者进一步地使用一株近期报道的高效阻断单抗RUPA-117[11]结合Pfs48/45抗原的能力，发现额外引入的糖修饰会大幅降低抗体对6C.mAgE2+4Gly的结合，对6C.mAgE2+6Gly的影响更加明显。因此，可扩展TB31F表位区域且仍能稳定TB31F识别构象的Pfs48/45抗原改造最利于激发多克隆TRA抗体反应。
最后，作者探索多聚化对抗原诱导TRA抗体反应的影响。首先通过标准膜喂养实验（SMFA）分析CPQ改造的6C.WT、6C.sAgE7、6C.mAgE1、6C.mAgE2产生抗体的阻断传播水平，发现改造后的抗原诱导功能性抗体的水平比野生型至少高1-2个数量级。接着，作者将6C.WT、6C.sAgE7、6C.mAgE2分别融合至I53-50A蛋白纳米笼[12]或转铁蛋白纳米笼[13]表面，并分别进行2次小鼠免疫，间隔28天，至42天时评估效果。发现经I53-50改造后产生的抗体滴度和TRA效果均明显提高，显示出多聚化免疫原诱发抗体反应的优越性。而且多聚化的免疫增强效果在不同平台（I53-50或转铁蛋白）间无显著差异。此外，相较于野生型融合至I53-50颗粒仅能达到35.5%的TRA，6C.sAgE7和6C.mAgE2融合至I53-50颗粒、及6C.mAgE2融合至转铁蛋白颗粒均可达到接近100% TRA。由此表明，对Pfs48/45抗原进行多个疫苗多聚化平台改造均可产生高效TRA效果。
回顾全文，作者将此前在病毒抗原改造中屡获成功的理性设计方法引入疟原虫蛋白Pfs48/45的改造中，获得生理特性、抗体滴度、TRA效果显著提升的突变体抗原，从而在概念上验证借助抗体结构-功能信息仅对抗原进行分子稳定性改造，就足以改进一种寄生虫靶标蛋白的免疫反应水平。当然，本文的免疫效果验证均在小鼠水平进行，其结论在人体中是否依然适用仍需实验验证，期待该工作的后续进展报道。
（来源：BioArt）
参考文献：
1. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/elimination/countries-and-territories-certified-malaria-free-by-who
2. World Health Organization (2021). World malaria report 2021. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2021
3. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/malaria
4. White, M.T., et al. (2015). Immunogenicity of the RTS,S/AS01 malaria vaccine and implications for duration of vaccine efficacy: secondary analysis of data from a phase 3 randomised controlled trial. Lancet Infect. Dis. 15, 1450–1458.
5. Acquah, F.K., et al. (2019). Transmission-blocking vaccines: old friends and new prospects. Infect. Immun. 87. e00775–e00718.
6. Kundu, P., et al. (2018). Structural delineation of potent transmission-blocking epitope I on malaria antigen Pfs48/45. Nat. Commun. 9, 4458.
7. van Dijk, M.R., et al. (2001). A central role for P48/45 in malaria parasite male gamete fertility. Cell 104, 153–164.
8. Singh, S.K., et al. (2021). A reproducible and scalable process for manufacturing a Pfs48/45 based Plasmodium falciparum transmission-blocking vaccine. Front. Immunol. 11, 3369.
9. Kundu, P., et al. (2018). Structural delineation of potent transmission-blocking epitope I on malaria antigen Pfs48/45. Nat. Commun. 9, 4458.
10. Huang, W.C., et al. (2018). A malaria vaccine adjuvant based on recombinant antigen binding to liposomes. Nat. Nanotechnol. 13, 1174–1181.
11. Fabra-Garc？′a, A., et al. (2021). Potent human monoclonal antibodies target different domains of Malaria transmission blocking vaccine candidate Pfs48/45 (American Society of Tropical Medicine and Hygiene). nr 1166.
12. Brouwer, P.J.M., et al. (2019). Enhancing and shaping the immunogenicity of native-like HIV-1 envelope trimers with a two-component protein nanoparticle. Nat. Commun. 10, 4272.
13. Wuertz, K.M.G., et al. (2021). A SARS-CoV-2 spike ferritin nanoparticle vaccine protects hamsters against Alpha and Beta virus variant challenge. npj Vaccines 6, 129.
链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761322003508?via%3Dihub
